Gazzetta n. 116 del 21 maggio 2003 (vai al sommario) MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE E FORESTALI DECRETO 8 maggio 2003 Metodi ufficiali di analisi per i fertilizzanti (supplemento n. 8). L'ISPETTORE GENERALE CAPO dell'ispettorato centrale repressione frodi Vista la legge 7 agosto 1986, n. 462, con la quale e' stato, tra l'altro, istituito l'Ispettorato centrale repressione frodi per l'esercizio delle funzioni inerenti alla prevenzione e alla repressione delle infrazioni nella preparazione e commercio dei prodotti agro-alimentari e delle sostanze di uso agrario e forestale; Visto l'art. 3 della legge 9 marzo 2001, n. 49, riguardante «Ulteriori interventi per fronteggiare l'emergenza derivante dall'encefalopatia spongiforme bovina», secondo il quale, nell'ambito delle disposizioni in materia di controlli e di personale, l'Ispettorato centrale repressione frodi, posto alle dirette dipendenze del Ministro delle politiche agricole e forestali, opera con organico proprio ed autonomia organizzativa ed amministrativa e costituisce un autonomo centro di responsabilita' di spesa; Visto il decreto del Presidente della Repubblica 18 gennaio 1988 che, tra le funzioni attribuite alle divisioni dell'Ispettorato centrale repressione frodi, prevede l'elaborazione e l'aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi per i prodotti agro-alimentari e le sostanze di uso agrario e forestale; Visti gli articoli 8 e 9 della legge 19 ottobre 1984, n. 748, concernente: «Nuove norme per la disciplina dei fertilizzanti», i quali prescrivono che i concimi e gli ammendanti e correttivi vengano controllati con i metodi di campionamento e di analisi adottati con decreto del Ministro dell'agricoltura e delle foreste, sentito il parere della Commissione di cui agli articoli 110, 111 e 112 del decreto del Presidente della Repubblica 12 febbraio 1965, n. 162; Visto altresi' l'art. 115 del citato decreto del Presidente della Repubblica 12 febbraio 1965, n. 162; Visti i decreti ministeriali 24 marzo 1986, 19 luglio 1989, 23 gennaio 1991, 10 marzo 1993, 28 settembre 1993, 5 dicembre 1995, 21 dicembre 2000 e 17 giugno 2002, relativi all'approvazione dei «Metodi ufficiali di analisi per i fertilizzanti», pubblicati rispettivamente nei supplementi ordinari alla Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 180 del 5 agosto 1986, n. 196 del 23 agosto 1989, n. 29 del 4 febbraio 1991, nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 73 del 29 marzo 1993, nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 238 del 9 ottobre 1993, nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 18 del 23 gennaio 1996, nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 21 del 26 gennaio 2001 e nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 220 del 19 settembre 2002; Ritenuto necessario aggiornare i metodi di analisi approvati con i succitati decreti ministeriali; Sentito il parere della commissione per l'aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi - sottocommissione fertilizzanti, rinnovata col decreto ministeriale 20 settembre 2000, pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 236 del 9 ottobre 2000, modificata da ultimo, per quanto attiene la sottocommissione fertilizzanti, col decreto ministeriale 28 settembre 2000 pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 249 del 24 ottobre 2000; Visto il decreto legislativo 30 marzo 2001, n. 165, concernente norme generali sull'ordinamento del lavoro alle dipendenze delle amministrazioni pubbliche; Vista la direttiva 98/34/CE, concernente le procedure d'informazione nel settore delle norme e regolamentazioni tecniche, e successive modificazioni, attuata con decreto legislativo 23 novembre 2000, n. 427; Decreta: Art. 1. 1. Sono approvati i «Metodi ufficiali di analisi per i fertilizzanti - Supplemento n. 8» descritti nell'allegato al presente decreto; 2. I metodi di analisi riportati in allegato al presente decreto si applicano ai concimi nazionali.   Art. 2. Il presente decreto entra in vigore il giorno successivo alla sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana. Roma, 8 maggio 2003 L'ispettore generale capo: Lo Piparo   ALLEGATO Metodo per identificare la presenza di "Sangue" nei fertilizzanti 1. Oggetto Il presente documento fissa un metodo quali-quantitativo per identificare e determinare la presenza di "sangue" nei fertilizzanti. 2. Campo d'applicazione Il metodo e' applicabile ai concimi organici azotati "sangue secco" e "sangue fluido". La stessa metodica puo' essere utilizzata anche per verificare (analisi qualitativa) la presenza di "sangue" nei seguenti fertilizzanti: "Miscela di concimi organici N e NP" e nei concimi organo-minerali contenenti "sangue secco" e "sangue fluido". 3. Principio La proteina piu' importante e caratteristica presente nel sangue e' l'emoglobina. Si tratta di una proteina globulare caratterizzata dalla presenza del gruppo prostetico eme che contiene ferro (Fe 2+), facilmente rilevabile per via spettrofotometrica nello spettro del visibile. Nel presente metodo, il gruppo eme dell'emoglobina del sangue viene estratto mediante una soluzione di trietanolammina e caratterizzato per via spettrofotometrica. Il massimo di assorbanza dell'emoglobina si ha per alfa = 406,8 nm. Il contenuto di emoglobina nei concimi organici azotati e' determinato confrontando l'assorbanza a 406,8 nm dell'estratto in trietanolammina con quello di uno standard di emoglobina. Per l'accertamento qualitativo della presenza di "Sangue" in concimi contenenti oltre al sangue altre matrici organiche e' necessario eseguire uno spettro di assorbimento nella regione di lunghezza d'onda (alfa) compresa fra 340 e 500 nm. Dalla derivata prima [f'(x)] di questo spettro di assorbimento e' possibile determinare la presenza di emoglobina osservando la presenza di un picco caratteristico a 420 nm. 4. Reattivi Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualita' analitica riconosciuta. 4.1. Emoglobina (substrato per proteasi, sec. Anson). 4.2. Trietanolammina, C6H15N03, (99%. 4.3. Soluzione di trietanolammina al 5%. Sciogliere 50 mL di trietanolammina (4.2.) in 500 mL di acqua in un matraccio da 1000 mL e portare a volume con acqua. La soluzione deve essere conservata in un contenitore a chiusura ennetica e mantenuta a + 4°C. 4.4. Soluzione di trietanolammina al 2,5% a pH 9,2. Sciogliere 25 mL di trietanolammina (4.2.) 500 mL di acqua in un matraccio da 1000 mL e portare a volume con acqua. La soluzione deve essere conservata in un contenitore a chiusura ermetica e mantenuta a +4°C. In alternativa, diluire al 50% (v/v) la soluzione di trietanolammina al 5% (4.3.) con acqua deionizzata. Portare quindi la soluzione a pH 9,2 con HCl 0,1M (4.6.). 4.5. Acido cloridrico, HCl, 36%. 4.6. Soluzione di acido cloridrico 0,1 M. Diluire 83,33 mL di HCl 36% (4.5.) in un matraccio tarato da 1000 mL con acqua fino a volume. AVVERTENZE: alcuni reagenti usati in questa procedura sono pericolosi; osservare particolare cura durante il loro utilizzo. Evitare il contatto con la pelle ed occhi e l'inalazione dei vapori. Si raccomanda all'operatore di osservare le indicazioni riportate sull'etichetta del contenitore dei prodotti ed eventualmente consultare le relative schede di sicurezza per le specifiche informazioni sulla pericolosita' dei reagenti usati e sulle modalita' di smaltimento. 5. Apparecchiatura 5.1. Spettrofotometro UV/VIS dotato di software per l'elaborazione dei risultati (calcolo della derivata prima). 5.2. Agitatore magnetico con piastra riscaldante. 5.3. Termometro tarato fino a 100°C. 5.4. Piaccametro. 5.5. Filtri di carta tipo Whatman n. 42. 5.6. Stufa. 6. Procedimento 6.1. Preparazione dei campioni per l'analisi I campioni solidi devono essere macinati e setacciati a 0,45 mm secondo quanto previsto dal metodo "Preparazione del campione per l'analisi" (D.M. 24 marzo 1986). I campioni fluidi devono essere accuratamente agitati e omogeneizzati prima di essere sottoposti ad analisi. 6.2. Estrazione dell'emoglobina 6.2.1. Concimi organici azotati "sangue secco" e "sangue fluido" 6.2.1.1. Campioni solidi Pesare 0,125 g di campione, con una precisione di 0,1 mg, in un matraccio da 100 mL, aggiungere 50 mL di soluzione di trietanolammina al 5% (4.3.) e porre il matraccio sull'agitatore magnetico (5.2.) preriscaldato a 85°C. Controllare la temperatura della sospensione e quando ha raggiunto 85°C continuare l'agitazione per 30 minuti. Raffreddare la sospensione a temperatura ambiente, aggiustare il pH a 9,2 mediante l'aggiunta di HCl 0,1 M (4.6.), portare a volume con acqua deionizzata. Travasare quantitativamente in un matraccio tarato da 500 mL (0,25 g L-1) e portare a volume con trietanolammina al 2,5% a pH 9,2 (4.4.). Filtrare su filtro di carta (5.4.). 6.2.1.2 Campioni fluidi Pesare 1 g di campione, con una precisione di 0,1 mg, in un matraccio da 100 mL, aggiungere 50 mL di soluzione di trietanolammina al 5% (4.3.) e porre il matraccio sull'agitatore magnetico (5.2.) preriscaldato a 85°C. Procedere quindi come descritto al punto 6.2.1. 6.2.2. Miscela di concimi organici N e NP e concimi organo-minerali contenenti "sangue secco" e/o "sangue fluido" Pesare 1 g di campione di concime in un matraccio da 100 mL, con una precisione di 0,1 mg, aggiungere 50 mL di soluzione di trietanolammina al 5% (4.3.) e porre il matraccio sull'agitatore magnetico (5.2.) preriscaldato a 85°C. Controllare la temperatura della sospensione e quando ha raggiunto 85°C continuare l'agitazione per 30 minuti. Raffreddare la sospensione a temperatura ambiente, aggiustare il pH a 9,2 mediante l'aggiunta di HCl 0,1 M (4.6.), portare a volume con acqua deionizzata, filtrare su filtro di carta (5.4.). 6.3. Preparazione degli standard di emoglobina (da preparare solo nel caso di campioni di concimi organici azotati "sangue secco" e "sangue fluido") Preparare delle soluzioni da 50, 100, 150, 200, 250, 300 e 350 mg L-1 di emoglobina (4.1.) in trietanolammina al 25% a pH 9,2 (4.4.). 6.4. Misure allo spettrofotometro 6.4.1. Concimi organici azotati: "sangue secco" e "sangue fluido" Utilizzando lo spettrofotometro UV/VIS (5.1.) procedere alla misura dell'assorbanza degli standard di emoglobina (6.3.) e degli estratti diluiti (6.2.1 e 6.2.2.) alla lunghezza d'onda (alfa) di 406,8 nm utilizzando celle con percorso ottico di 1 cm e leggendo contro bianco preparato usando la soluzione di trietanolammina al 2,5% (4.4.) portata a pH 9,2 con HCl 0,1 M (4.6.). 6.4.2. Miscela di concimi organici N e NP e concimi organo-minerali contenenti "sangue secco" e/o "sangue fluido". Utilizzando lo spettrofotometro UV/VIS (5.1.) registrare uno spettro di assorbimento dell'estratto nella regione di lunghezza d'onda (alfa) compresa tra 340 e 500 nm utilizzando celle con percorso ottico di 1 cm e leggendo contro un bianco preparato usando la soluzione di trietanolammina al 2,5% a pH 9,2 (4.4.). Memorizzare gli spettri d'assorbimento per il successivo calcolo della derivata prima della funzione. 7. Espressione dei risultati 7.1. Concimi Organici azotati: "sangue secco" e "sangue fluido" Utilizzare la curva di taratura costruita con lo standard di emoglobina per determinarne la concentrazione negli estratti: Emoglobina (mg g-1) = (a abs340 - m) / b . c dove, a = coefficiente angolare della retta di regressione lineare ottenuta dall'interpolazione della curva di taratura dell'emoglobina (concentrazioni dell'emoglobina in mg L-1), abs340 = assorbanza a 406,8 nm dell'estratto di concime, m = intercetta della retta di regressione lineare ottenuta dall'interpolazione della curva di taratura dell'emoglobina, b = costante di cella dello spettrofotometro (1 cm), c = concentrazione del campione nell'estratto analizzato (g L-1). Da una serie di campioni di concimi analizzati nelle condizioni sperimentali descritte in questo metodo, e' stato possibile stabilire che il valore medio di presenza di emoglobina nei concimi organici azotati "sangue secco" e "sangue fluido" era pari all'81,4% con una deviazione standard di 5,0 (dato espresso p/p sulla sostanza secca). Si ritiene pertanto ragionevole stabilire che nei concimi organici azotati "sangue secco" e "sangue fluido" la percentuale di emoglobina nel campione analizzato debba essere > 75% (dato espresso p/p sulla sostanza secca). 7.2. Miscela di concimi organici N e NP e concimi organo-minerali contenenti "sangue secco" e/o "sangue fluido". In questi campioni, dove la presenza di "sangue" dichiarata puo' essere dell'ordine del 5-10% (la legge 19 ottobre 1984 n. 748 consente la dichiarazione in etichetta delle matrici organiche solo se presenti in quantita' ( 5% in peso del concime), si' deve procedere alla determinazione della derivata prima [f'(x)] dello spettro di assorbimento del campione nell'intervallo compreso tra 340 e 500 nm (6.4.). La presenza di "sangue" e' determinabile, nella derivata prima [f'(x)] dello spettro di assorbimento, dalla presenza di un picco caratteristico a 420 nm. Estrazione e Caratterizzazione Elettroforetica del DNA Fungino da Matrici Organiche 1. Oggetto Il presente documento fissa un metodo per l'estrazione di DNA genomico di funghi da matrici organiche. E' stata sviluppata una procedura veloce per estrarre DNA genomico da biomasse organiche in meno di 30 minuti. Questo metodo, oltre ad essere notevolmente rapido, evita l'utilizzo di solventi organici tossici come il fenolo ed il cloroformio utilizzati nei metodi tradizionali (Van Burik et al., 1998). Permette di ottenere circa 1-50 µg di DNA genomico di dimensioni comprese tra le 6 e le 25 kilobasi (kb), a seconda del tipo di suolo e del numero degli organismi presenti. Tale metodo e' stato adattato alla caratterizzazione di materiale genetico fungino in biomasse organiche di diversa origine. 2. Campo di applicazione Il metodo e' utilizzabile per estrarre DNA genomico da miceli o spore fungini in biomasse organiche di diversa origine. Principio Il sistema, grazie all'utilizzo di un micronizzatore (o disgregatore) e ad una attenta scelta dei reagenti, e' in grado di lisare le cellule e stabilizzare il DNA con perdite minime di acidi nucleici. 3. Reagenti 4.1. Tampone di fosfato di sodio 4.2. Tampone MT 4.3. Soluzione precipitante per proteine 4.4. Matrice ad elevata affinita' per il DNA 4.5. Soluzione di lavaggio priva di DNAasi contenente etanolo e sali. Aggiungere 100 mL di etanolo a 12 mL di soluzione madre (SEWS-M) priva di DNAasi. Agitare e conservare a temperatura ambiente. 4.6. Soluzione di eluizione del DNA. H2O ultra-pura. 4.7. TAE 1X (Tris-EDTA-Acetato). Soluzione base (50X): disciogliere 242 g di Pris base e 57,1 g di acido acetico glaciale in 100 ml di EDTA 0,5 M (pH 8): portare quindi a volume finale di 1 L con H2O distillata. 4.8.Agarosio 4.9. Bromuro di etidio (EtBr): 3,8 diamino-5-etil-6-fenilfenantridiobromuro (????). Soluzione base: aggiungere 10 mg di EtBr per ml di H2O distillata, agitare e conservare a 4°C in bottiglia scura. Per ottenere la concentrazione di lavoro diluire la soluzione madre fino ad ottenere 0,5-1 µg/mL di EtBr. 4.10. Blu di bromofenolo (BBF). Aggiungere 0,25% di blu di bromofenolo e 40% di saccarosio in H2O distillata; conservare a 4°C. 4.11. DNA plasmidico di riferimento 5. Apparecchiatura 5.1. Tubi di polietilene (forniti col kit), contenenti una miscela di microsferette in ceramica e in silicio di due diverse dimensioni, disegnate per lisare efficacemente qualsiasi tipo di microrganismo, compresi quelli storicamente difficili da lisare come le spore eubatteriche e le endospore, batteri gram-positivi, lieviti, alghe, nematodi e funghi. 5.2. Filtri che assorbono il DNA (forniti col kit) 5.3. Tubi porta-filtro (forniti col kit) 5.4. Disgregatore FastPrep 120 Instruments, Q-Biogene (RESNOVA) o analoghi, con rotore da 12 posti per tubi da 2 ml, in grado di agitare i tubi in ogni direzione a velocita' molto elevate. 5.5. Cella elettroforetica orizzontale con elettrodi di platino 5.6. Alimentatore elettrico (5-200V- 200 W max) 5.7. Fransilluminatore a raggi UV con sistema di acquisizione fotografica dell'immagine 5.8. Micropipette: P100. P200. P1000 6. Procedimento 6.1. Estrazione del DNA Porre il campione (100-500 mg se secco o 350-800 µL se liquido) nei tubi di polietilene contenenti una miscela di microsferette in ceramica e in silicio ed aggiungere 978 µL di tampone di fosfato di sodio e 122 µL di tampone MT. A causa del vigoroso movimento sviluppato dallo strumento, e' stata osservata una pressione significativa sul tubo. Il contenuto non dovrebbe superare i 7/8 del volume totale del tubo. Lo spazio lasciato migliora notevolmente l'omogeneizzazione del campione. Inserire i tubi nel disgregatore (5.4.) e processare i campioni per 20 secondi a velocita' 6,5 dello strumento. Centrifugare nuovamente i tubi per 5 minuti a 13.000 giri/minuto e trasferire i surnatanti (circa 700-800 µL) in tubi nuovi. Aggiungere 250 µL di soluzione che precipita le proteine (4.3.) e agitare ad inversione a mano per 10 volte. Centrifugare quindi i tubi per 5 min ad una velocita' di 13.000 giri/minuto e trasferire i supernatanti in nuovi tubi da 15 mL, in cui si aggiungeranno 500 µL di matrice con affinita' per il DNA (4.4., risospendere la soluzione, agitando bene prima dell'uso). Agitare per inversione su un rotore, oppure a mano, per 10 minuti per consentire al DNA di legarsi alla matrice ed attendere 5 min affinche' precipiti la resina; togliere quindi, con cautela, 500 µL del supernatante, senza toccare la resina, e buttarlo via. Risospendere quindi la resina rimanente col surnatante rimasto, e trasferirne circa 600 µL in un filtro che assorbe il DNA (5.2.) inserito in un tubo porta-filtro (5.3.). Centrifugare i campioni per 1 min a velocita' 13.000 giri/minuto e poi svuotare i tubi porta-filtro (5.3.); aggiungere quindi il surnatante rimasto nel filtro che assorbe il DNA (5.2.). Centrifugare ancora per 1 min a velocita' 13.000 giri/minuto ed aggiungere 500 µL di soluzione di lavaggio (4.5.) sul filtro. Centrifugare ancora per 1 min a 13.000 giri/minuto di velocita', svuotare i tubi porta filtro e centrifugare ancora una volta per 2 mm a 13.000 giri/minuto per asciugare bene la resina. Infine svuotare i tubi porta-filtro (5.3.), trasferire i filtri che assorbono il DNA in nuovi tubi porta-filtro e lasciare ad asciugare per 5 minuti con il tappo aperto a temperatura ambiente. Aggiungere dunque 100 µL di soluzione di eluizione del DNA (4.6.) ai filtri che assorbono il DNA e risospendere delicatamente la resina con la punta della pipetta. Infine centrifugare per 2 min a 13.000 giri/minuto, aggiungere quindi altri 50 µL di soluzione di eluizione del DNA (4.6.) al filtro e centrifugare per altri 2 min a 13.000 giri/minuto di velocita'. Conservare quindi il supernatante con il DNA eluito, che puo' essere analizzato. 6.2. Analisi del DNA La presenza di acidi nucleici viene valutata sia quantitativamente, tramite spettrofotometria all'ultravioletto (260 nm) o tramite lettura al fluorimetro, che qualitativamente tramite elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%. Con la prima tecnica e' anche possibile valutare il grado di purezza dei DNA estratto. La seconda tecnica, oltre a consentire una valutazione approssimativa della quantita' del DNA estratto, e' soprattutto indicata per la determinazione della qualita' del DNA, analizzando le dimensioni del DNA estratto in modo da valutarne l'integrita'. 6.2.1. Determinazione per spettrofotometria all'ultravioletto Prelevare un'aliquota del DNA estratto (pochi µL) e portare a volume di 1 mL con acqua distillata sterile. Quindi pone la soluzione in una cuvetta di quarzo per rilevazioni spettrofotometriche all'UV e procedere alla lettura allo spettrofotometro. Accendere lo spettrofotometro circa 20 minuti prima dell'effettuazione delle letture, in modo da consentire il riscaldamento della lampada all'UV, precedentemente selezionata nel vano portalampade dello strumento. Procedere quindi alla lettura dei campioni. Le lunghezze d'onda alle quali vengono letti i campioni sono: 240 nm, 260 nm, 280 nm. Le letture alle lunghezze d'onda di 240 e 280 nm forniscono informazioni sulla presenza di proteine, mentre la lettura a 260 nm e' specifica per le molecole di DNA. Moltiplicare i dati ottenuti dalla lettura a 260 nm per un coefficiente di 50 nel caso si voglia determinare la concentrazione del DNA. Riportare le concentrazioni in mg/mL. Dal rapporto tra le letture a 260 nm e 280 nm (260/280) si ottiene l'indice di purezza del DNA estratto. Se il valore ditale rapporto risulta compreso tra 1,7 e 2,0 il DNA risulta sufficientemente puro. 6.2.2. Fluorescenza Il metodo si basa sulla proprieta' che ha una soluzione colorante Hoechst 33258 di formare legami con l'adenina e la timina presenti nella molecola di DNA e di emettere fluorescenza. In questo modo si puo' determinare in maniera precisa la concentrazione del DNA presente nella soluzione rilevando la fluorescenza emessa dal quantitativo che ha interagito con il DNA. Per operare tali determinazioni e' necessario effettuare una retta di calibrazione dello strumento utilizzando una soluzione madre di DNA preparata in modo tale da essere sicuri che il DNA che si vuole analizzare abbia la stessa percentuale di adenina e timina di quello utilizzato per La calibrazione dello strumento. Al contrario della spettrofotometria UV, le impurita' che normalmente si possono ritrovare nel DNA (proteine, oligonucleotidi e solventi organici) non causano la minima influenza nella determinazione quantitativa del DNA. In relazione alla preparazione del fluorimetro, si rimanda alla documentazione del manuale allegata al tipo di strumento utilizzato. 6.2.3. Gel elettroforesi Il metodo consiste nella risoluzione del DNA presente nei campioni per elettroforesi su gel di agarosio, seguita da colorazione con bromuro di etidio. Preparazione del gel: Porre 100 mL di Tris Acetato EDTA (lX) (4.7.) e 0,8 g di agarosio (4.8.) in una beuta da 250 mL. Scaldare la beuta (utilizzando un forno a microonde, un bunsen od una piastra riscaldante) fino ad Ottenere una soluzione limpida, evitando di raggiungere la temperatura di ebollizione. Quindi attendere che la temperatura scenda al di sotto dei 60°C ed aggiungere 5 µL di soluzione di bromuro di etidio (1 µg/ml) (4.9.). Allestire la slitta per la preparazione del gel di agarosio, ponendola su un piano in bolla e disponendo gli opportuni pettini nelle apposite fessure. Versare delicatamente la soluzione preparata di agarosio nella slitta in triodo che risulti spesso non piu' di 5 mm, evitando la formazione di bolle d'aria ed attendendo che solidifichi (30-45 minuti a temperatura ambiente). Versare una piccola quantita' di tampone sul gel e togliere quindi delicatamente i pettini. Corsa elettroforetica Allestire la cella elettroforetica versandovi un volume di tampone (TAE lX) (4.7) sufficiente a riempirla per i 3/4 circa. Porre la slitta contenente il gel all'interno della cella elettroforetica (5.5.) in modo che il tampone ne ricopra la superficie (per circa 1 mm). Caricare 40 µL di DNA + 5 µL di blu di bromofenolo (4.10) nei pozzetti del gel ed un DNA plasmidico di riferimento (4.11). Collegare gli elettrodi della cella elettroforetica con l'alimentatore (5.6.) ed impostare ad una tensione costante di 120 V per tutta la corsa elettroforetica (per migliorare la risoluzione delle bande e' consigliabile utilizzare un basso voltaggio e prolungare il piu' possibile la corsa). Trascorsi 45 minuti (e' meglio osservare il gel agli UV una volta dopo 15 minuti ed una seconda dopo 45 minuti: se il DNA e' molto frammentato e/o scarso si rischia di non vederlo piu' dopo una corsa prolungata), interrompere l'alimentazione e togliere la slitta contenente il gel dalla cella elettroforetica. Scansione del gel Togliere delicatamente il gel dalla slitta e porlo sul transilluminatore (5.7.). Accendere la lampada UV ed effettuare l'acquisizione dell'immagine con un apposito sistema fotografico. Analisi dei risultati Su un gel di agarosio e' possibile discriminare visivamente frammenti di DNA di dimensioni >10 ng: La presenza di DNA genomico ad alto peso molecolare e' quindi facilmente verificabile con l'aiuto di un apposito DNA di riferimento. 7. Note Nel caso si voglia determinare la concentrazione dell'RNA con metodo spettrofotometrico all'ultravioletto come descritto al punto 6.2.1., e' necessario moltiplicare i dati ottenuti dalla lettura a 260 nm per il coefficiente 40, anziche' 50. Alcuni reagenti usati in questo metodo sono tossici. In particolare, il reagente 4.4. contiene tiocianato di guanidina (CH5N3-HSCN), altamente tossico, mentre il reagente 4.9. e' costituito da EtBr, potente mutageno. Evitare quindi per entrambi il contatto con la pelle ed occhi e l'inalazione dei vapori, utilizzando guanti e maschera di protezione. Si raccomanda inoltre all'operatore di osservare le indicazioni riportate sull'etichetta del contenitore dei prodotti ed eventualmente consultare le relative schede di sicurezza per le specifiche informazioni sulla pericolosita' dei reagenti usati e sulle modalita' di smaltimento. Il presente metodo ha fornito i migliori risultati estrattivi utilizzando Kit specifici per miceli fungini esistenti in commercio. Test di biodegradabilita' per sostanze organiche alilatiche di sintesi nei fertilizzanti 1. Oggetto Il presente documento fissa un metodo convenzionale per la determinazione della biodegradabilita' delle sostanze organiche di sintesi. 2. Campo di applicazione Il metodo e' applicabile a tutte le sostanze organiche alifatiche sintetiche contenute nei prodotti fertilizzanti. 3. Principio La determinazione della biodegradabilita' viene effettuata in ambiente acquoso aerobico misurando la quantita' di anidride carbonica che si sviluppa ad opera di ceppi batterici selezionati (normalmente presenti nel terreno agrario) rapportandola alla quantita' che il fertilizzante avrebbe dovuto sviluppare in base al contenuto di carbonio organico determinato con il metodo Springer-Klee (D.M. 21 dicembre 2000 - Gazzetta Ufficiale della Repubblica Italiana n. 21 del 26 gennaio 2001 - Serie generale). Il procedimento viene mantenuto sotto controllo sottoponendo al trattamento un opportuno standard di riferimento strutturalmente simile al composto od ai composti organici di cui si desidera valutare la biodegradabilita'. 4. Reattivi Nel corso dell'analisi utilizzare reagenti di qualita' analitica riconosciuta. 4.1. Acqua bidistillata, esente da sostanze tossiche (in particolare da rame), a basso contenuto di carbonio (< 2,0 mg/L TOC), con resistivita' (18 megaohms/cm. 4.2. Soluzione madre contenente microelementi preparata a partire da: EDTA sale sodico 0,15 g MgSO4 . 7H2O 3,0 g MnSO4 . 2H2O 0,5 g NaCl 1,0 g FeSO4 . 7H2O 0,1 g CoSO4 o CoCl2 0,1 g CaCl2 . 2H2O 0,1 g ZnSO4 0,1 g CuSO4 . 5H2O 0,01 g AlK(SO4)2 0,01 g H3BO3 0,01 g Na2MoO4 . 2H2O 0,01 g Sciogliere e portare a 1000 mL con acqua (4.1.), pH 7,2 ± 0,2. 4.3. Soluzione madre vitaniinica preparata a partire da: Biotina(vitaniina FI) 2,0 mg Acido folico 2,0 mg Piridossina cloridrato (B6) 10,0 mg Tiamina cloridrato (B1) 5,0 mg Riboflavina (B2) 5,0 mg Acido nicotinico (PP) 5,0 mg Pantenolo 5,0 mg Vitamina B12 0,1 mg Acido p-aminobenzoico 5,0 mg Acido lipoico 5,0 mg Sciogliere e portare a 1000 mL con acqua (4.1.). 4.4. Terreno di coltura preparato a partire da: Soluzione madre 4.2. 10,0 ml Soluzione madre 4.3. 10,0 ml K2HPO4 0,3 g (NH4)2SO4 1,0 g Sciogliere e portare a 1000 mL con acqua(4.1.). 4.5. Substrato di laboratorio. Per la selezione in purezza dei batteri usare Nutrient Broth (NB) agarizzato costituito da: Estratto di carne 2,0 g Peptone batteriologico 5,0 g Agar batteriologico 15,0 g Portare a 1000 mL con acqua (4.1.), pH 6,8 ± 0,2. 4.6. Soluzione di NaOH 0,5N. 4.7. Soluzione di BaCl2 . 2H2O 1M. 4.8. Soluzione di HCl 1N. 4.9. Soluzione di fenolftaleina. 5. Apparecchiatura Per ciascun prodotto da esaminare (il fertilizzante, la sostanza di riferimento e il bianco) e in base al numero di replicati necessari, l'apparecchiatura prevede l'impiego di 5 contenitori di vetro collegati in serie ad una valvola regolatrice di flusso elettronica o manuale che permette di regolare e mantenere un flusso costante di aria, pari a 600 mL/h. 5.1. L'impianto si articola nelle seguenti parti (figura 1): ----> vedere immagine a pag. 19 della G.U. <---- 5.1.1. Linea di decarbonatazione. L'aria erogata da una bombola viene fatta passare in una linea di decarbonatazione e deumidificazione costituita da colonne contenenti calce sodata e gel di silice, seguite da una colonna di policarbonato di altezza pari a due metri contenente acqua, avente lo scopo di compensare eventuali sbalzi di pressione creatisi nel sistema. 5.1.2. Reattori per la degradazione. Flaconi di vetro scuro della capacita' di 500 mL, con tappo a vite forato a tenuta, dotati di un tubo pescante in entrata da cui gorgoglia l'aria decarbonatata. Una seconda apertura, chiusa con tappo a tenuta, consente di misurare l'attivita' dell'inoculo, il pH e la temperatura. I reattori vanno protetti dalla luce per impedire la proliferazione di alghe e mantenuti sotto costante agitazione. 5.1.3. Polmoni di sicurezza. Ogni reattore e' preceduto e seguito da una beuta vuota, a tenuta, della capacita' di 500 mL, per impedire il ritorno della soluzione di NaOH o del terreno di coltura dalle trappole al reattore e/o da quest'ultimo alle valvole regolatrici di flusso. 5.1.4. Trappole per CO2. Batteria di due assorbitori (drechsell) della capacita' di 150 mL collegate in serie, contenenti ciascuna 100 mL di NaOH 0,5 N. 5.2. Preparazione dell'inoculo. L'obiettivo e' quello di isolare dal terreno microrganismi in grado di utilizzare il fertilizzante come substrato nutritivo. Si consiglia di selezionare da 3 a 5 ceppi batterici scegliendo un terreno agrario di tessitura equilibrata e di media fertilita'. A tale scopo, si aggiunge 1 g di terreno ad una beuta contenente 250 mL di terreno di coltura (4.4,) sterilizzato e addizionato di fertilizzante, portato a pH 7 e messo ad incubare a 28°C per 5 giorni in termostato, sotto costante agitazione. La procedura, in duplicato, deve essere realizzata in contemporanea con un test privo del prodotto in esame. Dopo sviluppo si lascia decantare brevemente e si procede ad una semina su piastre contenenti il substrato di laboratorio NB agarizzato (4.5.) riproducendo le diluizioni da 10-1 a 10-10 (usare per le diluizioni soluzione fisiologica sterile), lasciando poi incubare a 28 °C in termostato per 3 giorni. Le colonie batteriche evidenziatesi vanno isolate e riprodotte in purezza. I ceppi batterici selezionati vanno infine inoculati in ragione dell' 1-2% in 30 mL di NB liquido (4.5., privo di agar batteriologico), contenuti in provette da 50 mL e fatti sviluppare in terinostato sotto costante agitazione a 28°C per 3 giorni. La miscela di microrganismi viene successivamente lavata con soluzione fisiologica sterile e centrifugata a 6000 giri per 20 minuti. Tale operazione deve essere ripetuta almeno 3 volte. L'inoculo per la prova respirometrica si ottiene miscelando le cellule batteriche provenienti dai lavaggi e soluzione fisiologica sterile. Esso deve contenere 107 unita' formanti colonie (UFC) per mL, accertato mediante standard turbidimetrico e va impiegato lo stesso giorno della preparazione. 5.3. Prova respirometrica. La determinazione della biodegradabilita' riguardera' il fertilizzante in esame, lo standard di riferimento scelto e un bianco e, per ciascuno di questi campioni, sara' effettuata in duplicato. 5.3.1. Preparazione dei campioni. Il materiale da analizzare deve essere una soluzione vera o una sospensione omogenea. Se non si verifica questa condizione occorre diluire con acqua (4.1.). La soluzione dello standard di riferimento deve avere un titolo in C analogo alla soluzione o sospensione della sostanza da esaminare. 5.3.2. Esecuzione della prova. Nei reattori di ciascuna linea di analisi si introducono 200 mL di terreno di coltura (4.4.), a cui si aggiunge l'inoculo in ragione dell'1% (V/V). Si manda quindi in pressione l'impianto e si lascia aerare per 24 ore con aria decarbonatata, per eliminare la CO2 presente nel sistema. Al termine della ventilazione le due trappole per la C02 vengono riempite ciascuna con 100 mL della soluzione di NaOH 0,5N. Nel reattore di ciascuna linea, eccettuati quelli per lo studio del "bianco", viene quindi introdotto il substrato da analizzare in quantita' equivalenti a 40,91 mg di Corg, corrispondenti ad uno sviluppo teorico di 150 mg di CO2. La CO2 svolta nei reattori viene condotta dal flusso d'aria nelle trappole, dove reagisce con la soluzione di NaOH, producendo Na2CO3. La prova deve essere effettuata alla temperatura costante di 25°C. 5.3.3. Determinazione della CO2. A date prestabilite, corrispondenti ai giorni 2, 4, 8, 16 e 25 dall'inizio della prova, viene staccato l'assorbitore di CO2 piu' vicino al reattore. La quantita' di CO2 svolta viene determinata titolando il contenuto delle trappole con una soluzione di HCl 1N, previa aggiunta di 20 mL di BaCl2 . 2H2O 1M in presenza di fenolftaleina. Il secondo assorbitore viene avvicinato di un posto al reattore stesso e all'estremita' della serie si aggiunge un nuovo assorbitore contenente 100 mL di soluzione fresca di NaOH 0,5N. 6. Calcolo della biodegradazione e conclusioni La quantita' di CO2 sviluppata viene calcolata nel seguente modo: mg CO2 (B - V) N E dove: V = volume (mL) di acido per titolare la soda nei collettori di CO2 dei campioni trattati B = volume (mL) di acido per titolare la soda nei collettori di CO2 dei campioni controllo N = normalità dell'acido E = PE co2 = 22 La biodegradazione del prodotto viene espressa percentualmente in termini di CO2 sviluppata entro il 25° giorno di prova (B25°) rispetto alla CO2 teoricamente sviluppabile in base al contenuto di carbonio organico determinato con il metodo Springer-Klee (D.M. 21 dicembre 2000 - Gazzetta Ufficiate della Repubblica Italiana n. 21 del 26 gennaio 2001 - Serie generale). mg CO2 sviluppata B25°% =------------------------------- x 100 mg CO2 teorica Sono ritenute biodegradabili le sostanze organiche alifatiche di sintesi che mostrano entro 25 giorni un tasso di mineralizzazione non inferiore al 50% rispetto al contenuto di C organico determinato sperimentalmente. I risultati della prova di degradazione si considerano validi se sono soddisfatte le seguenti condizioni: nella stessa serie di determinazioni, il prodotto di riferimento deve dare una biodegradazione uguale o superiore all'80% entro 25 giorni. In caso contrario, l'intera serie deve essere scartata e la prova ripetuta; durante la prova, nelle bottiglie del "bianco" non deve verificarsi uno sviluppo significativo di CO2, che non puo' superare 5 mg di CO2 per 200 mL di soluzione. A titolo esemplificativo viene riportato il diagramma di biodegradabilita' di una sostanza organica alifatica di sintesi. ----> vedere diagramma a pag. 22 della G.U. <---- Determinazione del grado d'idrolisi nei fertilizzanti a base di proteine idrolizzate 1. Oggetto Il presente documento fissa un metodo per la determinazione del grado d'idrolisi nei fertilizzanti. 2. Campo di applicazione Il metodo e' applicabile ai concimi organici azotati ed agli ammendanti a base di idrolizzati proteici. 3. Principio Il grado di idrolisi qui proposto e' calcolato sulla base del rapporto tra il contenuto in azoto (-amminico (N() e l'azoto organico (Norg) del fertilizzante. Il contenuto in N( e' valutato per via spettrofotometrica utilizzando l'o-ftaldialdeide (OPA) come agente derivatizzante. 4. Reattivi Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualita' analitica riconosciuta. 4.1. Sodio tetraborato decaidrato (Na2B4O7 . 10 H2O) = 99,5%. 4.2. Soluzione di sodio tetraborato (4.1) 0,1 mal L-1; pesare 38,14 g di sodio tetraborato (4.1) in un pallone da 1000 mL contenente 500 mL di acqua, agitare fino alla completa dissoluzione e portare a volume con acqua. Se correttamente conservata questa soluzione ha una durata di alcuni mesi. 4.3. Sodio dodecil solfato (SDS) (C12H25NaO4S) = 99%. 4.4. Soluzione di SDS (4.3) al 20 % (p/p), pesare in un pallone tarato da 50 mL 10 g di SDS (4.3), aggiungere acqua e dissolvere sotto leggera agitazione, quindi portare a volume con acqua. Per ottenere dei risultati piu' accurati si consiglia di filtrare la soluzione su carta prima dell'uso. Se correttamente conservata ha una durata di alcuni mesi. 4.5. O-ftaldialdeide (OPA) (C8H6O2) = 99%. 4.6. Metanolo (CHOH3) = 99,8%. 4.7. Soluzione di OPA (4.5), in una provetta di vetro con chiusura ermetica pesare 200 mg di OPA (4.5), aggiungere 5 mL di metanolo (4.6), chiudere ermeticamente ed agitare fino alla completa dissoluzione dell'OPA. Questa soluzione deve essere preparata al momento e deve essere mantenuta al buio. 4.8. 2-mercaptoetanolo (C2H6OS) = 99%. AVVERTENZE: Alcuni reagenti usati in questa procedura sono pericolosi; osservare particolare cura durante il loro utilizzo. Evitare il contatto con la pelle ed occhi e l'inalazione dei vapori. Si raccomanda all'operatore di osservare le indicazioni riportate sull'etichetta del contenitore dei prodotti ed eventualmente consultare le relative schede di sicurezza per le specifiche informazioni sulla pericolosita' dei reagenti usati e sulle modalita' di smaltimento. 5. Apparecchiatura 5.1. Siringhe da 1 mL tipo usa e getta. 5.2. Filtri da siringa da 1 mL con pori del diametro di 0,45 µm in politetrafluoroetilene (PTFE). 5.3. Spettrofotometro dotato di lampada UV. 5.4. Cellette in quarzo da 1,5 mL con cammino ottico lungo 1 cm. 6. Procedimento 6.1. Preparazione del campione per l'analisi Omogeneizzare accuratamente il campione, quindi pesare circa 50 mg di campione all'interno di un matraccio tarato da 10 mL e annotare la pesata (circa 5 g L-1), portare a volume con acqua e agitare fino alla completa omogeneizzazione. Quindi filtrare un'aliquota del campione, prima dell'analisi, con una siringa (5.1.) utilizzando filtri da 0,45 µm (5.2.). 6.2. Preparazione del derivatizzante Lavorando sotto cappa chimica, porre in un pallone tarato da 50 mL nell'ordine: 25 mL di soluzione di sodio tetraborato (4.2.), 2,5 mL di soluzione di SDS (4.4.), 1 mL di soluzione di OPA (4.7.), 100 µL di 2-mercaptoetanolo (4.8.), portare a volume con acqua, agitare dolcemente fino alla completa omogeneizzazione. Preparare, inoltre, una soluzione contenente gli stessi reagenti sopra riportati con l'esclusione dell'OPA. Questa soluzione serve per la misura del background del campione. Queste soluzioni devono essere preparate al momento dell'uso e conservate al buio, a +4°C (o sotto ghiaccio) per tutta la durata dell'analisi. 6.3. Misure allo spettrofotometro Accendere lo spettrofotometro (5.3.); selezionare la lunghezza d'onda (?) di misura a 340 nm e attendere il tempo necessario per scaldare la lampada. Quindi all'interno di una celletta di quarzo (5.4.) mettere nell'ordine 10 µL di soluzione di campione preparato (6.1.) e 990 µL di soluzione di derivatizzante (6.2.), agitare brevemente per inversione, riporre la celletta nello spettrofotometro a temperatura ambiente e dopo 2 minuti esatti registrare il valore di assorbanza a 340 nm. Per la misura del background del campione operare come sopra riportato, utilizzando al posto della soluzione derivatizzante (6.2.) la soluzione senza l'OPA. 6.4. Determinazione dell'azoto organico La determinazione dell'azoto organico deve essere effettuata secondo i metodi ufficiali riportati nel Decreto Ministeriale 24 marzo 1986. 7. Espressione dei risultati ----> vedere testo a pag. 25 della G.U. <---- In teoria, un campione completamente idrolizzato dovrebbe avere tutto l'azoto organico in forma a-amminica e quindi un grado d'idrolisi prossimo a cento. Nota: l'OPA, in ambiente alcalino e in presenza di 2-mercaptoetanolo, non reagisce con le ammine che presentano un gruppo epsilon-amminico (ad es. la prolina e l'idrossiprolina). Pertanto questo metodo tende a sottostimare il grado d'idrolisi reale del fertilizzante che contenga apprezzabili quantita' dei suddetti amminoacidi. Determinazione del potassio nei concimi mediante spettrofotometria di assorbimento atomico 1. Oggetto Il presente documento fissa un metodo per la determinazione del potassio solubile in acqua. 2. Campo di applicazione Il metodo si applica per la determinazione del potassio solubile in acqua in tutti i concimi nazionali aventi un titolo in ossido di potassio inferiore o uguale al 30% p/p. 3. Principio Il potassio contenuto nel concime viene solubilizzato con acqua e determinato mediante spettrofotometria di assorbimento atomico con atomizzazione di fiamma. 4. Reattivi Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o demineralizzata di purezza equivalente e reattivi di qualita' analitica riconosciuta. 4.1. Fosfato monopotassico purissimo (KH2PO4). 4.2. Acido cloridrico, soluzione 6M circa. Diluire un voLume di HCl 37% (p = 1,186) con un volume d'acqua. 4.3. Cesio o in alternativa sodio, soluzione 10 g/L. In un matraccio tarato da 1000 mL, sciogliere g 12,7 di CsCl o g 14,7 di CsNO3 oppure g 25,0 di NaCl in 150 mL di acqua; aggiungere poi 85 mL di HCl (4.2.). Completare a volume con acqua ed omogeneizzare. 4.4. Potassio, soluzione standard a 1000 mg/L. Pesare g 3,4806 di KH2PO4 (4.1.), precedentemente essiccato a 120°C per 2 ore, e trasferirli quantitativamente in un matraccio tarato da 1000 mL, lavando il pesafiltri con acqua. Sciogliere completamente il sale e portare a volume con acqua. 4.5. Potassio, soluzioni standard di lavoro. Dalla soluzione (4.4.) prelevare con buretta da 25 mL (5.4.) 0-5-10-15 mL da trasferire in altrettanti matracci da 500 mL. Addizionare a ciascun matraccio 50 mL della soluzione di cesio o di sodio (4.3.) e portare a volume con acqua. Le soluzioni contengono rispettivamente 0-10-20-30 mg/L di K. 5. Apparecchiatura 5.1. Spettrofotometro di assorbimento atomico dotato di lampada a catodo cavo per potassio e bruciatore con testa da 50 mm di cammino ottico, alimentato con miscela acetilene-aria. 5.2. Matracci tarati da 500 e 1000 mL. 53. Pipette tarate a doppia tacca di classe AS da 5 mL. 5.4. Buretta graduata da 25 mL, divisione 0,05 mL. 6. Procedimento 6.1. Preparazione del campione per l'analisi Preparare il campione secondo quanto previsto dal punto 6 del Metodo 4.1 riportato nella Parte I della raccolta dei metodi ufficiali di analisi. 6.2. Preparazione della soluzione Procedere come descritto al punto 7.1 del Metodo 4.1 precedentemente menzionato, pesando g 10 (con l'approssimazione di 0,001 g) di campione e portando al volume finale di 1 litro (V1). 6.3. Preparazione della soluzione da sottoporre a spettrofotometria di assorbimento atomico. Dalla soluzione ottenuta come descritta a1 punto 6.2., prelevare, con la pipetta (5.3.), 5 mL (V2) e trasferirli in un matraccio da 500 mL Addizionare 50 mL della soluzione di cesio o sodio (4.3.) e portare a volume con acqua(V). Il peso del campione ed i volumi V1 e V2 possono essere opportunamente variati in funzione del contenuto in potassio del campione da sottoporre ad analisi. 6.4. Curva di taratura Preparare la curva di taratura allo spettrofotometro utilizzando la lunghezza d'onda di 766,5 nm. Posizionare il bruciatore con testa ruotata di 90° rispetto al cammino ottico. Predisporre sullo strumento la lampada specifica per il potassio selezionando la lunghezza d'onda sopra riportata. Azzerare lo spettrofotometro con la soluzione standard priva di potassio. Rilevare di seguito le assorbanze delle soluzioni standard di lavoro e costruire la curva di taratura riportando su carta millimetrata, in ordinata le assorbanze ed in ascissa le relative concentrazioni. 6.5. Dosaggio Rilevare le assorbanze della soluzione in esame operando nelle stesse condizioni descritte al punto 6.4.. Riportare i valori di assorbanza sulla curva di taratura e leggere i corrispondenti valori di concentrazione di potassio in mg/L. 7. Espressione del risultati Il contenuto di potassio solubile in acqua si esprime come percentuale di K2O che si ricava utilizzando la seguente espressione: C . 1,204 . V .V1 . 100 K2O% = --------------------------- V2 . P dove: C = concentrazione di K in mg/L riscontrata nella soluzione in esame 1,204 = fattore di trasformazione da K a K2O V = volume finale della soluzione in litri (nel caso attuale V = 0,5) V1 = volume finale della prima diluizione V2 = volume prelevato per la seconda diluizione P = peso del campione analizzato espresso in mg. Determinazione del cromo esavalente (CrVI) nei fertilizzanti contenenti sostanza organica 1. Oggetto Il presente documento fissa un metodo per la determinazione del cromo esavalente nei fertilizzanti contenenti sostanza organica sotto forma di cromati e/o bicromati in concentrazione superiore a 0,5 mg/kg come Cr(VI). 2. Campo di applicazione Il metodo e' applicabile ai fertilizzanti contenenti sostanza organica. 3. Principio Il cromo esavalente di un fertilizzante viene estratto in acqua e successivamente determinato sulla soluzione filtrata mediante reazione colorimetrica con s-difenilcarbazide per via spettrofotometrica a 540 nm. 4. Reattivi Nel corso dell'analisi utilizzare acqua deionizzata o demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualita' analitica riconosciuta. 4.1. s-difenilcarbazide [CO(NHNHC6H5)2] peso molecolare = 242,28. 4.2. Acido fosforico, H3PO4 85% (p = 1,7 g/mL). 4.3. Etanolo, CH3 CH2 OH 95%. 4.4. Bicromato di potassio, K2Cr2O7> 99% (p/p). 4.5. Soluzione di s-difenilcarbazide. 4.5.1 Soluzione A - In un matraccio da 500 mL aggiungere 150 mL di H3PO4 85% (4.2.) a 300 mL di acqua deionizzata, raffreddare e portare a volume con acqua deionizzata. 4.5.2 Soluzione B - Pesare 200 mg di s-difenilcarbazide (4.1.) in un matraccio tarato da 100 mL e aggiungere 80 mL di etanolo (4.3.), agitare fino a completa dissoluzione e portare a volume con etanolo (4.3.). 4.5.3 Soluzione C - Prelevare 400 mL della soluzione A (4.5.1.) e travasare in bottiglia di vetro scuro, quindi aggiungere lentamente la soluzione B (4.5.2.) agitando continuamente. La soluzione finale ottenuta non deve presentare alcuna colorazione, altrimenti occorre ripetere la preparazione delle soluzioni 4.5.1. (Sol. A) e 4.5.2. (Sol. B). Questa soluzione deve essere conservata in frigorifero (4 °C) in bottiglia scura e per un periodo non superiore a 3-4 giorni. 4.6 Soluzione standard di Cr(VI). 4.6.1 Sale di K2Cr2O7 (4.4.): Essiccare in stufa a 105 °C il bicromato di potassio (4.4.) fino a peso costante (2 ore possono considerarsi sufficienti). 4.6.2 Soluzione madre di Cr(VI) (20 mg/L). Pesare 56,55 mg di K2Cr2O7 essiccato (4.6.1.), porlo in matraccio tarato da 1000 mL, aggiungere circa 800 mL di acqua deionizzata, sciogliere il sale e quindi portare a volume con acqua deionizzata. 4.6.3 Soluzione madre diluita di Cr(VI) (2 mg/L). Diluire 1:10 (v/v) la soluzione madre di K2Cr2O7 (4.6.2.). 5. Apparecchiatura Nel corso dell'analisi utilizzare corrente attrezzatura e vetreria da laboratorio e in particolare: 5.1. Spettrofotometro per misure nei campo del visibile munito di vaschette con cammino ottico da 1 cm, oppure colorimetro a filtri con massimo di trasparenza ottica attorno a 540 nm, munito di vaschette con cammino ottico da 1 cm. 5.2. Bilancia analitica. 5.3. Stufa per umidita' (105 °C). 5.4. Filtri da 0,45 µm. 5.5. Pompa a vuoto. 5.6. Agitatore meccanico. 5.7. Tubi da centrifuga da 200 mL. 6. Procedimento 6.1. Curva di calibrazione del Cr(VI). Si consiglia di preparare la curva di calibrazione con quantita' crescenti di Cr(VI) a partire dalla concentrazione di 20 µg di Cr(V1)/L. Preparare la curva di calibrazione con 1 - 2,5 - 5 - 10 - 15 e 20 µg di Cr(VI) per campione, corrispondenti a concentrazioni di 20, 50, 100, 200, 300 e 400 µg/L di Cr(VI); Aggiungere 0,5; 1,25; 2,5; 5; 7, 5; 10, mL di soluzione madre diluita di Cr esavalente (4.6.3.) in matracci da 50 mL, aggiungere acqua deionizzata fino a circa 40 mL dove necessario, quindi addizionare 5 mL di soluzione C (4.5.3.) contenente s-difenilcarbazide, miscelare accuratamente, portare a volume con acqua deionizzata e quindi miscelare nuovamente. Lasciare riposare per circa 40 minuti e procedere alla lettura spettrofotometrica a alfa = 540 nm utilizzando possibilmente cuvette da 1 cm di spessore leggendo i campioni contro una soluzione di riferimento (bianco A). Il bianco A deve essere preparato come segue: in un matraccio tarato da 50 mL, aggiungere 40 mL di acqua deionizzata e addizionare 5 mL di soluzione C (4.5.3), miscelare accuratamente, portare a volume con acqua deionizzata e omogeneizzare nuovamente. 6.2. Estrazione del Cr(VI). Pesare 5 g di campione, preventivamente macinato e setacciato a 0,45 mm secondo quanto previsto dal metodo "Preparazione del campione per l'analisi" (D.M. 24 marzo 1986), porlo in un tubo da centrifuga da 200 mL e quindi addizionare 100 mL di acqua deionizzata (rapporto campione:acqua 1:20). Agitare il campione per 2 ore a temperatura ambiente e circa 100 oscillazione per minuto, quindi filtrare su carta da filtro tipo Whatman n. 42, oppure centrifugare a 2500 rpm per 20 minuti e filtrare a 0,45, µm per rimuovere eventuali particelle in sospensione. 6.3. Determinazione del Cr(VI) negli estratti. In matraccio tarato da 50 mL aggiungere 40 mL di estratto (6.2.), quindi 5 mL di soluzione C (4.5.3.), miscelare accuratamente, portare a volume con acqua deionizzata e omogeneizzare nuovamente. Lasciare riposare per circa 30 minuti e procedere alla lettura spettrofotometrica a alfa = 540 nm utilizzando possibilmente cuvette da 1 cm di spessore leggendo i campioni contro una soluzione di riferimento (bianco B). Il bianco B: in un matraccio da 50 mL aggiungere 40 mL dell'estratto del campione impiegato per la reazione colorimetrica e portare a volume con acqua deionizzata,, omettendo cosi' solo l'aggiunta della s-difenilcarbazide (questo serve per eliminare le possibili sovrastime determinate dalle sostanze colorate presenti nell'estratto che assorbono a 540 nm). La soluzione colorata cosi' ottenuta e' stabile per almeno 6 ore. 7. Espressione dei risultati I risultati ottenuti si esprimono utilizzando la seguente espressione: µg di Cr(VI) dell'estratto x D Cr(VI) (µg/g/mg/kg) = ---------------------------------- peso del campione (g) dove: D = fattore di diluizione = volume dell'estraente/volume prelevato per la determinazione (in questo caso: 100:40 2,5) Nota La concentrazione di 0,5 mg/kg di Cr(VI) corrisponde al limite di sensibilita' (rilevabilita) della metodica. Conseguentemente, per valori inferiori a tale limite, quindi non rilevabili, e' possibile utilizzare la dicitura "assenza di Cr(VI)". Interferenze - Sostanze ossidabili (sostanze organiche, Fe ++, ecc.) possono ridurre il Cr(VI) solubilizzato a Cr(III), dando percio' risultati in difetto. Tale possibile riduzione viene limitata operando l'estrazione e la determinazione del Cr(VI) in tempi brevi. La reazione sulla quale si basa la determinazione del Cr(VI) nel filtrato e' assai specifica tanto che alla lunghezza d'onda di 540 nm le interferenze sono praticamente trascurabili con una banda passante dello strumento sufficientemente stretta. Tuttavia, interferenze positive possono essere costituite dai sali di mercurio (Hg) e di molibdeno Mo(VI) che reagiscono con la s-difenilcarbazide dando luogo a complessi colorati; in ogni modo la debole intensita' della colorazione consente di tollerare concentrazioni dell'interferente fino a 200 mg/L. Causa d'interferenza negativa puo' essere costituita dalla presenza di sostanze ossidanti, come NO3; (per concentrazioni superiori a 5 mg/L) e cloro libero (per concentrazioni superiori a 2 mg/L) che provocano decomposizione del complesso colorato.